risoluzione dei problemi del DNA

Hai bisogno di aumentare la purificazione del tuo DNA genomico con il kit di purificazione del DNA genomico Monarch (NEB #T3010)? Siamo qui per essere di aiuto. I suggerimenti e i trucchi per la risoluzione dei problemi forniscono una panoramica dei problemi di routine che gli scienziati devono affrontare durante la disintossicazione del gDNA. Puoi anche fare riferimento a ciascuna risorsa online “Selezione delle quantità iniziali quando si tratta del kit di purificazione del DNA genomico Monarch” per indicazioni sulla selezione delle quantità di test efficaci.? Contatta il nostro supporto tecnico quasi in qualsiasi momento.

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PROBLEMA MOTIVO SOLUZIONE

BASSO REDDITO celle La sfera della camera congelata è stata associata a una sospensione o scongelamento

  • Scongela lentamente il pellet del cellulare sul ghiaccio e scuoti, vedi, il tubo più volte per collegare ciascun pellet al fondo del suo tubo. In tutti i casi, iniziare a utilizzare PBS freddo per la risospensione in aggiunta a quello risospendere delicatamente pipettando e di conseguenza a destra 5-10 volte appropriate fino a quando non si ottiene senza dubbio una sospensione cellulare uniformemente torbida e il pellet è praticamente completamente disciolto.
  • Aggiunto buffer di lisi cellulare durante l’operazione con gli enzimi

  • Aggiungere la Proteinasi K e la RNasi A al campione e mescolare bene prima di aggiungere il carico di lisi cellulare, altrimenti la notevole viscosità di tutto il lisato impedirà agli enzimi lontani di mescolarsi correttamente.
  • sangue Sangue umano scongelato che fornisce attività DNasi

  • Conservare i campioni di sangue al gelo e non. Applicare la proteinasi K, la RNasi A e il tampone di lisi del sangue direttamente per assistere i campioni invernali. Avviare immediatamente la lisi e di conseguenza consentire ai campioni di scongelarsi completamente durante la lisi di incubazione.
  • Campione di sangue troppo vecchio

  • Il sangue originale al 100% (non congelato) non deve rimanere più vecchio di una settimana. Le vecchie prove dovrebbero mostrare una perdita graduale della quantità di DNA e l’efficienza della degradazione.
  • Shaping che soffre di selezioni

  • L’emoglobina digestiva dalle analisi del sangue intero con alcune specie animali con contenuto di emoglobina aumentato (ad esempio, porcellini d’India) può molto probabilmente portare ad un accumulo che si trasforma in insolubile con complessi di emoglobina che colorano e ostruiscono la membrana, riducendo la resa e la salubrità. Ridurre il tempo di lisi della proteinasi K di appena 5 3 al minimo per evitare la formazione di questo tipo di precipitati.
  • tessuto I pezzi di stoffa erano sempre grandi

  • Taglia il materiale di partenza in una nuova bacchetta più piccola o macina con azoto succo vegetale. In grandi pezzi creati dal tessuto, le nucleasi devono distruggere permanentemente il DNA prima che la proteinasi K possa lisare il tessuto di una persona e rilasciare anche il DNA.
  • Membrana otturata rispetto alle cellule dei tessuti

  • Fibre proteinasi

    La digestione K, che coinvolge i tessuti muscolari fibrosi (p. es., muscoli, cuore, erba, clip delle stazioni radio), il tessuto cerebrale e qualsiasi tessuto muscolare stabilizzato dall’RNA, provoca il rilascio di un po’ di fibre proteiche indigeribili, che spesso danno alcune delle il lisato un nuovo aspetto torbido. Queste fibre bloccano uno specifico blog di legame sulla membrana di questo composto organico, riducendone la produzione e causando un altro virus proteico. Per rimuovere le fibre, centrifugare quelle lisate alla massima velocità per 3 minuti come indicato in questo protocollo. Non utilizzare mai più rispetto a 12-15 mg di materiale di partenza per l’ascolto di clip e tessuto cerebrale, altrimenti la rimozione dei resti non sarà completa.

  • Un’istanza nel punto di servizio scadente

  • I campioni conservati per lunghi periodi a temperatura ambiente, 4°C e -20°C mostrano degradazione e persino diminuzione del contenuto di gDNA in un attimo. Congelare i tessuti con cibo, azoto liquido o ghiaccio secco e conservare a -80°C. In alternativa, utilizzare reagenti stabilizzanti per proteggere realmente il gDNA dell’individuo e consentire una conservazione più lunga a 4°C su -20°C.
  • Il DNA genomico è stato degradato (di solito presente nei tessuti ricchi di DNasi)

  • I tessuti degli organi, come di solito il pancreas, l’intestino, le feci e il fegato, presentano quantità significative di nucleasi. Hanno davvero bisogno di essere maneggiati con estrema cura conservati correttamente per evitare la distruzione del DNA. Conservare congelato su ghiaccio durante la preparazione del sottogruppo. Vedere il protocollo per pezzi di denaro consigliati di materiale di partenza e materiale di proteinasi K.
  • Colonna sovraccarica di DNA

  • I tessuti di alcuni organi (es. milza, soluzione, fegato) hanno dimostrato di essere estremamente ricchi di DNA genomico. Il tentativo di elaborare quantità maggiori anziché le quantità di input raccomandate porta anche a grovigli di frammenti di gDNA lunghi e confusi che non possono essere eluiti dallo strato di tessuto di silice. Diminuisci L’importo dei costi dei materiali che possono ottenere una resa maggiore.
  • Aggiunta errata K-proteinasi totale

  • La maggior parte dei campioni sembra essere un rifiuto con 10 µl di proteinasi K, ma i risultati migliori si ottengono da 3 µl per il cervello, i reni e inoltre le clip per le orecchie.
  • DNA Rowspan=”3″>Tessuto Decomposizione del modello

  • I campioni conservati per lunghi periodi solo ad alta temperatura ambiente, 4°C o -20°C sono destinati a dimostrare la degradazione e la perdita nel tempo del contenuto di gDNA. Tenere i campioni di tessuto sotto shock, liquefatti con azoto o in alternativa possibilmente ghiaccio secco e conservare a -80°C. In alternativa, è possibile utilizzare reagenti di supporto come RNAlater per sostenere il gDNA e conservarlo a 4°C e potrebbe essere solo -20°C per diversi mesi.
  • Le sciarpe possono essere troppo grandi

  • Tagliare le materie prime in piccoli pezzi e macinarle con l’aiuto dell’azoto liquido. In frammenti più grandi le nucleasi tissutali scompongono tutto il DNA prima che la proteinasi K lisi il tessuto e lasci cadere qualsiasi tipo di DNA.
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